直觀檢測環境雌激素的轉基因斑馬魚系的建立及其應用研究

【摘要】： 環境雌激素(EEs)是指能夠模擬體內天然雌激素功能的人工合成或植物提取的化合物。這些物質已被證明能夠導致動物和人類的性別混淆和生殖功能受損。此外,它們還能誘導雄性和幼年魚類表達雌性特異性蛋白,如卵黃蛋白原(VTG)。 為了能快速、直觀、活體檢測環境雌激素,我們建立了轉基因斑馬魚系。首先,我們用RT-PCR和整體原位雜交的方法顯示了雌激素類化合物17α-炔雌醇(EE_2)誘導斑馬魚卵黃蛋白原1(zvtgl)基因在胚胎和幼魚體內的表達模式。第二,我們克隆了zvtgl基因上游兩段調控序列,并使其在MCF-7細胞株中誘導表達下游綠色熒光蛋白基因(gpf),由此體外驗證1720bp DNA片段具有啟動子活性。第三,融合基因zvtgl:gfpl顯微注射1-2細胞期的斑馬魚胚胎中,經EE_2處理后幼魚肝臟出現綠色熒光。由此從活體驗證1720bp DNA片段的啟動子活性。第四,為了增強轉基因斑馬魚綠色熒光蛋白的表達,我們合成了一段來源于爪蟾卵黃蛋白原A2基因的39bp的DNA片段,該片段含有雌激素反應元件(ere)的序列。這段DNA插入zvtgl啟動子的上游,得到融合基因ere-zvtgl:gfp,并顯微注射斑馬魚胚胎。然后用10ng/L的EE_2處理6天,用熒光顯微鏡觀察肝臟熒光,進行篩選。出現熒光的幼魚繼續飼養至性成熟,與野生型斑馬魚雜交,其后代也用10ng/L的EE_2處理6天,觀察熒光進行篩選。在119條F0代斑馬魚中,發現一條能將熒光傳遞到F1代。最后只有兩條F1代雄魚存活下來,并和野生型雌魚雜交得到F2代。F2代的雌魚和雄魚互相交配,得到F3代。F3再和野生型雜交,用EE_2篩選出現熒光的F4代。最后,能將熒光100%傳遞到F4代的F3代被確定為純合子,從而建立ere-zvtgl:gfp轉基因斑馬魚系。 在這種轉基因斑馬魚系中,綠色熒光蛋白(GFP)特異性地在成熟雌魚肝臟表達。雄性和幼年轉基因斑馬魚不表達GFP,但是在EE_2誘導后其肝臟也能出現熒光。胚胎和幼魚中zvtgl mRNA和綠色熒光出現的時空一致,說明gfp基因是存zvtgl啟動子的調控下表達。 1-2細胞期的轉基因斑馬魚分別用100,10,1,0.1 ng/L的EE_2處理,最早觀察到熒光的時間分別為53,74,100和131小時。成年雄性轉基因斑馬魚分別用100,10,1,0.1 ng/L的EE_2處理,最早觀察到熒光的時間分別為2,3,4,和7天。成熟雌性轉基因斑馬魚雖然肝臟已經有熒光,但是相對較高濃度(10和100ng/L)的EE_2仍然能夠誘導熒光增強。隨著暴露時間的延長,肝臟的綠色熒光有增強趨勢,而撤去EE_2后一段時間熒光逐漸消失。分別用具有雌激素活性的化合物和沒有雌激素活性的甾體類激素測試ere-zvtgl:gfp轉基因斑馬魚發射熒光的反應,結果雌激素類物質處理幼魚13天后,誘導熒光所需的濃度分別為:已烯雌酚50 ng/L,雌二醇0.1μg/L,雌三醇1μg/L,氯化鎘10μg/L,玉米赤霉烯酮50μg/L,雙酚A 1mg/L。弱雌激素壬基酚濃度達到10mg/L時仍未能誘導綠色熒光出現。其它甾體類激素如孕激素和17-羥固醇即使濃度達到100mg/L和50mg/L,仍不能誘導熒光出現。這種轉基因斑馬魚能檢測濃度很低的環境雌激素,而且所需的暴露時間很短,因此有望應用于直觀,快速,簡便地監測環境雌激素。 利用這種轉基因斑馬魚系,研究EE_2誘導zvtgl表達的分子機制,結果提示雌激素受體β是EE_2誘導zvtgl表達所必須的;環境雌激素EE_2濃度達500ng/L時斑馬魚胚胎原始生殖細胞(PGCs)遷移異常,這種效應與雌激素受體無關。PGCs遷移異常對斑馬魚胚胎發育的影響正在研究中。