嗜水氣單胞菌侵襲機制及其胞外蛋白酶的研究

【摘要】： 致病性嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是我國淡水養殖魚類的重要病原對其侵襲機制和毒力因子的研究有重要的意義。本文對我國分離的致病性嗜水氣單胞菌AhJ-1株在體內、體外的侵襲機制以及其重要的毒力因子—胞外蛋白酶的產生條件，蛋白酶的致病性，蛋白酶的結構與功能之間的關系，蛋白酶的同源性以及結構預測進行了研究，并建立了一種檢測致病性嗜水氣單胞菌的PCR方法。 1 用HEp-2細胞和異育銀鯽作為細胞和動物模型，對嗜水氣單胞菌AhJ-1株的侵襲機制進行了體內和體外研究。采用慶大霉素裂解培養法對嗜水氣單胞菌魚源株AhJ-1對HEp-2細胞的侵襲特性進行了研究．結果顯示，AhJ-1在4℃時不具有侵襲力，在37℃時對HEp-2細胞的侵襲率達到0.2％；細菌在細胞內能增殖；細胞松弛素D和酪氨酸蛋白激酶抑制劑能抑制AhJ-1的侵襲，而酪氨酸蛋白磷酸化酶抑制劑卻能促進AhJ-1對HEp-2細胞的侵襲，Ca~(2+)通道阻斷劑對AhJ-1的侵襲力影響不大。表明AhJ-1對HEp-2具有侵襲力，且與溫度有關，信號轉導，細胞骨架參與了侵襲過程．將綠色熒光質粒轉化到AhJ-1株中，通過浸泡的方式對人工創傷、去除粘液，以及正常異育銀鯽進行感染，結果發現創傷組和去除粘液組在感染后24h，其各器官的含菌量均高于對照組，說明傷口、皮膚是嗜水氣單胞菌的感染途徑，天然屏障在魚類免疫中起重要作用。 2 對體外培養嗜水氣單胞菌的胞外蛋白酶(ECPase)產生條件進行了優化。結果發現，其產量與碳源、氮源、培養溫度、培養基初始pH值等有關。蔗糖能促進蛋白酶的產生，NH_4~+抑制蛋白酶的產生。其最佳產酶條件為：pH7.5的0.02mol／L KCl，0.06mol/L K_2HPO_4，5g·L~(-1)的蔗糖和5g·L~(-1)的胰蛋白胨水，28℃，150r·min~(-1)搖床培養65h。在此條件下酶活性可達20.8U·mL~(-1)。 3 以提純的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶(ECPase)注射異育銀鯽，鯽魚出現典型的由嗜水氣單胞菌引起的敗血癥癥狀。病魚體表充血、出血，鰓蒼白，腹部膨大，肛門紅腫突出，腹腔內有紅色的腹水，腸壁充血發炎。背部肌肉注射部位發生液化、糜爛，鱗片豎起。病魚各組織器官都有病變，其中尤以肝、腎最為嚴重。肝臟腫大，質地脆弱，肝細胞水腫，胞漿結構疏松。腎小體壞死以至解體，腎小管上皮細胞也發生病變．體外試驗表明，正常鯽魚血清中有某種成分能夠抑制蛋白酶的活性。 4 以攜帶質粒pAM120(Ap~r、Tc~r/Tn916)的大腸桿菌(E.coli)CG120株為供 摘要 體菌，與受體菌嗜水氣單胞菌Jl株，采用濾膜接合法進行接合轉移，在選擇平板（含 To、。fi和脫脂奶）上進行篩選，篩選出6株蛋白酗失株（ECPase勺，ECPase”菌株 其生長速度，對正常鯽魚血清的杭性降低，用脫脂奶平板法及底物法檢測，蛋白酶產 量明顯降低。與親本J八 比，突變株致病力降低，對鯽魚的半數致死量大于 10’U上 株對鯽魚的半數致死量為 5 x 10勺。用 ECPase”突變株 MJJ株的 18h培養物u x 10吐FU）接種健康鯽魚，不產生親本Jl株引起的病變及死亡。用 MJ刁活菌免疫鯽 魚，在第5周產生較高的凝集杭體，且對強毒株J二的攻擊有保護作用。表明蛋白酶 是嗜水氣單胞菌的一個重要的毒力因子，ECPase”突變株仍具有免疫原性。 5蛋白酶是嗜水氣單胞菌的重要致病因子，為研究其結構與功能之間的關系， 用DEPC、EDC、PMSF、N－AI等9種化學修飾劑處理嗜水氣單胞菌J1株胞外蛋白 酶ECPase54，然后檢測殘余酶活力，借以研究酶分子中貽酸側鏈基團與酶活性中 心的關系。結果表明，拋、絲氨酸、。躺、孤基等殘基與酶活性無關；半跳氨酸 殘基與酶活性也無直接關系；而色氨酸、組氨酸、酪氨酸殘基側鏈以及二在劑建的化學 修飾弓】起酶活性的大幅度的下降，說明色氨酸、組氨酸、酪氨酸殘基以及二ha．Mr是酶 活力所必需的基團。 6才瞄已發表的氣單胞菌胞外蛋白酶基因核旮晰列，設計和合成了一對引物， 以嗜水氣單胞菌 Ah上的基因組 DNA為模板，通過 PCR技術，擴增得到一 gil hp的 絲氨酸蛋白酶片段，并與pGEM1載體克隆連接，測序，進一步對擴增的絲氨酸蛋白 酶基因片段進行分析，發現與發表的嗜水氣單胞菌絲氨酸蛋白酶AheZ的同源性有 87％，擴增片段編碼343個躺酸，分子量為35700，有較高的抗原性。 7 fR4＆已發表的 16s iJNA基困序列氣溶素基因序列，設計 T 2對引物，建立 了檢測致病性嗜水氣單胞菌的PCR方法。通過對 12株氣單胞菌的檢測，發現 16s rDNA 引物具有高度的特異性，僅對嗜水氣單胞菌擴增陽性，而氣溶素引物檢測結果與采用 生物學方法檢測的結果相一致，且具有高度的敏感性，可檢測最低lfg的模板。該方 法的建立為致病性嗜水氣單胞菌的檢測提供了一種簡便、快速的途徑，是一種比較實 用的致病性嗜水氣單胞菌的檢測方法。