斑馬魚三個母源因子的表達及功能研究

【摘要】： 原始生殖細胞(Primordial germ cells, PGCs)是多細胞生物體中生殖細胞的祖先,同時也是研究細胞遷移的一個重要的模型。在果蠅、線蟲和小鼠等物種中,nanos在PGCs遷移過程中發揮作用,干涉該基因后,PGCs的遷移不正常。盡管Nanos蛋白在脊椎動物和無脊椎動物的PGCs的遷移中起著舉足輕重的作用,然而在斑馬魚中,Nanos如何調節PCGs的遷移的分子機制目前還不清楚。為了探討這一問題,我們以全長的Nanos為誘餌蛋白,通過酵母雙雜交系統篩選了一個新的與Nanos相互作用的蛋白,即肌球蛋白輕鏈2(Myosin light chain II, Mylz2); Nanos的鋅指結構域和C末端的14個氨基酸殘基是Nanos-Mylz2相互作用所必需,缺少這兩個部分中的任何一個,Nanos都不能與Mylz2相互作用。采用免疫共沉淀和GST pull-down方法,在體內、外證明了Nanos蛋白與Mylz2蛋白能形成一個穩定的復合體。用Mylz2磷酸化的抗體檢測,進一步證明了Nanos在人的293T細胞中下調Mylz2蛋白的磷酸化。結果分析Nanos可能通過調控Mylz2的磷酸化來調節斑馬魚PGCs的發育和遷移。 Pumilio和Nanos相互作用最早在果蠅中發現,其功能是調控胚胎的背、腹軸形成。隨后研究同樣發現,人的Pumilio2與Nanos的同源蛋白Nanos 1相互作用,在生殖細胞的發育和維持中發揮作用。在斑馬魚中,pumilio2的研究未見報道。本文通過序列比對,在斑馬魚EST數據庫中,發現了一個與pumilio2同源的EST序列。采用3’和5’末端快速擴增cDNA (RACE)方法,從斑馬魚卵巢中獲得了該基因的cDNA;通過測序和分析,該基因與pumilio2同源,因此命名為pum-like。斑馬魚pum-like的cDNA含有3861個堿基,編碼1106個氨基酸,通過與斑馬魚基因組數據庫比對,發現其定位于第25號染色體上,含有21個外顯子和20個內含子。同時將斑馬魚pum-like與人、果蠅等物種pumilio基因進行比對構建進化樹,結果表明,pum-like與其他物種pumilio2的同源性高于pumiliol。Pum-like的C端含有pumilio基因家族的5個PUF (Pumilio-family RNA binding repeat)結構域。免疫組織化學顯示,Pum-like在卵母細胞中進行表達。整胚原位雜交結果證明,pum-like mRNA在2細胞和4細胞的分裂溝中表達,隨著胚胎發育,其mRNA主要集中在腦和神經管中。因此,我們推測pum-like可能參與早期胚胎的細胞分裂,并與神經系統的發育和形成有關。 卵黃膜是位于卵母細胞外的一層膜結構,在動物的受精和胚胎發育過程中起著十分重要的作用。通過NCBI的數據庫和電子差減雜交的方法,在GeneBank斑馬魚卵巢的cDNA文庫中獲得一條EST序列(XM_001340234.1)；利用其EST序列,進行3’、5’RACE,獲得該基因的cDNA全長；通過PCR和測序驗證該基因的cDNA全長為2720bp,它編碼761個氨基酸。通過蛋白比對,發現該蛋白與已知的卵黃膜蛋白沒有同源性,因此我們認為它是一個新的卵黃膜蛋白,命名為斑馬魚卵黃膜蛋白zvep (zebrafish vitelline envelope protein)。通過RT-PCR和western blot檢測,zvep在卵巢和腦中表達,在其他組織中不表達。采用組織原位雜交和免疫組織化學證明zvep mRNA在卵母細胞的Ⅰ期,Ⅱ期,Ⅲ期轉錄,蛋白在Ⅲ期卵母細胞的卵黃膜上特異性的表達(陽性信號為2條細線)。以上結果表明,ZVEP在早期卵母細胞中合成,是卵黃膜中的一個新成員,在卵黃膜形成過程中發揮了重要作用。