Transcriptome Analysis and Expression of Immune-Related Genes in Megalobrama Amblycephala after Challenge with Aeromonas Hydrophila

【摘要】：團頭魴(Megalobrama amblycephala)是中國重要的淡水養殖草食性經濟魚類。嗜水氣單胞菌在團頭魴高密度養殖中的危害較為嚴重,可造成嚴重的經濟損失。迄今為止,有關團頭魴感染嗜水氣單胞菌的分子調控機理還未見報道,本研究通過注射嗜水氣單胞菌對團頭魴進行攻毒,采用高通量測序技術對攻毒前后6個組織進行了轉錄組分析及免疫基因的鑒定,分析了這些基因的調控與表達,探討了團頭魴對外源性病原體侵入的抵抗力和敏感性。主要內容如下：(1)對團頭魴腹腔注射1.7×105,1.7×106,1.7×107和1.7×108細胞每毫升等不同濃度的菌液,并在七天的實驗期觀察和記錄魚的患病癥狀和死亡情況。試驗結果表明,試驗魚的死亡率與細菌的感染濃度相關。與對照組0%相比,高濃度(1.7×108細胞每毫升)表現出100%死亡率(1天)。半致死劑量(LD50)為5×106細胞每毫升。在受感染后的團頭魴病理組織中分離嗜水氣單胞菌,對得到的15株菌進行形態特征觀察、生理生化試驗和DNA測序驗證,而對照組均未分離出此細菌。本研究結果表明,嗜水氣單胞菌為引起團頭魴體外出血性的病原。此外,對兩株菌(D4和HU201301)進行耐藥性試驗分析,結果表明兩株菌對各類抗生素藥物表現為高度敏感性。(2)利用RNA-seq技術,對團頭魴嗜水氣單胞菌感染前后的6個組織的混合樣本構建兩個cDNA文庫,然后進行Illumina HiSeq2000測序。通過de novo序列組裝,得到155,052個unigene(平均長度為692.8 bp),并對其進行了KOG, KEGG和GO注釋。86%的unigene與NR蛋白數據庫比對上。30,482個unigene注釋到GO分類上,25242個unigene注釋到“生物過程”,26096個注釋到“分子功能”,22778個注釋到“細胞組分”等三大生物類。在KOG和KEGG分析中,20909個unigene分為25 KOG類別,28744個unigene被注釋到315個特定信號通路。238個unigene(映射為125個基因)在兩個文庫中有顯著差異表達,其中101個上調和24個下調。另外,303個umgene識別為未知或新基因。在125個差異表達的基因中53個為免疫相關基因,其主要分布在71個信號通路中。(3)從團頭魴轉錄組序列中獲得了10,877個SSR分子標記,包括了二到五核苷酸重復序列,其中二核苷酸重復序列是最常見(7152,65.8%),其次是三核苷酸(3172,29.2%),四核苷酸(549,5.05%)和五核苷酸重復序列(4,0.04%)。微衛星序列的長度在12-25 bp之間?？捎糜谠O計微衛星引物的序列為5,077個(46.7%)。此外,本實驗共得到36,326個SNP分子標記,SNP的平均出現頻率為29.2 bp。轉換和顛換突變分別為21,445和12,553個,其比例為1.71。其中10,812個SNP分布在2421個unigene中,1628個unigene(包含7727個SNP)注釋到GO三大生物類別“生物過程”,“分子功能”和“細胞組分”。1324個unigene(包含5812個SNP)注釋到25個KOG分類。975個unigene(包含4589個SNP)注釋到278個KEGG通路中,其中111個unigene(包含600個SNP)注釋到KEGG“免疫系統”分類。這些數據為團頭魴種質資源評估和遺傳育種工作奠定了基礎。(4)利用計算機模擬分析方法對相應的免疫相關蛋白進行表征與同源建模分析,包括MaTLR5, MaNFKBIA, MaMyD88, MaTRAF6, MaC3, MaC7, MaCTSL, MaMMP-9, MaIL-8和MaIL-10等,對其理化和功能特性進行了預測和分析,并應用比較建模方法對其二級和同源建模結構進行了預測。(5)利用熒光定量(RT-qPCR)技術對團頭魴嗜水氣單胞菌感染后的免疫相關基因(如MaTLR5, MaNFKBIA, MaMyD88, MaTRAF6, MaC3, MaC7, MaCTSL, MaMMP-9, MaIL-8和 MaIL-10)進行表達分析。結果表明,這些免疫相關基因在肝、脾和腎(從4至120小時注射后)表現出高度上調或下調。本研究鑒定出的免疫相關基因與相關分析對團頭魴免疫功能研究具有重要作用,為其免疫機制和病害防治提供了分子生物學資料。