基于模式生物平臺研究酸棗仁湯對斑馬魚睡眠行為的影響

【摘要】：目的:失眠是一種常見的睡眠障礙性疾病,其發病率大概為10%-20%,其中,約有一半具有慢性病程。長期的失眠嚴重破壞人們的身心健康,給社會和家庭帶來沉重的經濟負擔?，F有的用于治療失眠的藥物受限于不可避免的不良副反應。因此,有必要尋找更為安全有效的治療方法。中醫藥是一種極具潛力的補充替代治療方法。酸棗仁湯是傳統中醫用于失眠治療的經典方藥,全方由酸棗仁、川芎、知母、茯苓、甘草五味藥物配伍而成,具有養血安神之功效。目前,其鎮靜催眠效應已在臨床藥理研究和斑馬魚外的一些動物模型中被證實,但是仍面臨著藥效物質基礎以及作用機制闡釋滯后的問題。斑馬魚模式生物行為學平臺的建立為鑒別酸棗仁湯的安眠活性成分以及探究其相關的作用通路提供了新思路和新手段。本研究旨在通過斑馬魚行為學藥物篩選平臺,評估酸棗仁湯、酸棗仁及其化學成分酸棗仁皂苷A對斑馬魚幼魚睡眠/覺醒行為的影響,鑒別酸棗仁皂苷A是否為酸棗仁湯的活性成分。通過比較分析酸棗仁皂苷A誘導的行為表型與已表征化合物誘導的行為表型,鑒別酸棗仁皂苷A可能作用的神經信號通路。進一步通過通路依賴性行為學實驗和分子生物學實驗驗證潛在的作用通路。為明晰酸棗仁湯安眠作用的藥效物質基礎及其潛在的作用機制提供一定數據。方法:采用全自動視頻追蹤系統對藥物處理后的斑馬魚幼魚進行連續24小時的行為學監測,分析與睡眠/覺醒相關的6個行為學參數(睡眠總時間、睡眠回合的次數、睡眠回合的長度、睡眠潛伏期、總的活動量、覺醒的活動量),并構建行為學指紋圖譜進行可視化。分別對睡眠和覺醒行為的代表性參數睡眠總時間和覺醒的活動量以10分鐘為間隔進行時間序列分析以及進行定量分析。對酸棗仁皂苷A誘導的行為學指紋圖譜與已表征的化合物誘導的行為學指紋圖譜進行相關性分析,計算皮爾森相關系數,并用熱圖可視化結果,同時對酸棗仁皂苷A和已表征的化合物的行為表型進行層次聚類分析,根據相關程度鑒別出候選神經信號通路。此外,利用表型缺陷的秀麗線蟲突變體進行通路依賴性行為學實驗,驗證酸棗仁皂苷A對候選神經通路的影響作用。最后,采用實時熒光定量PCR法檢測酸棗仁皂苷A對斑馬魚中的神經通路相關基因的mRNA表達水平的影響,從分子水平驗證酸棗仁皂苷A的作用與候選神經通路的相關性。成果:1.與空白對照比較,低、中、高濃度的酸棗仁湯均可增加斑馬魚幼魚的睡眠總時間、睡眠回合的長度、覺醒時的活動量以及白天的睡眠回合次數,并減少夜間的睡眠回合次數和白天的活動總量,縮短夜間的睡眠潛伏期。此外,低、中濃度酸棗仁湯可引起斑馬魚幼魚白天的睡眠潛伏期延長,與之相反,高濃度酸棗仁湯可縮短白天的睡眠潛伏期。至于夜間的活動總量,在中、高濃度中表現為增加,在低濃度中則為減少。與空白對照比較,低、中、高濃度的酸棗仁均可增加斑馬魚幼魚的睡眠總時間、睡眠回合的長度、白天的睡眠回合次數以及夜間的覺醒活動量,并減少睡眠潛伏期、白天的總的活動量以及白天的覺醒活動量。此外,夜間的睡眠回合次數在低濃度時表現為輕微增加,在中、高濃度時表現為減少。而夜間的總的活動量在低濃度時輕微減少,在中、高濃度時則相反。與空白對照相比,低、中、高濃度的酸棗仁皂苷A普遍增加斑馬魚幼魚的睡眠總時間、睡眠回合的長度以及白天睡眠回合的次數,并減少夜間睡眠回合的次數、總的活動量以及白天的覺醒活動量。此外,在測試的3個酸棗仁皂苷A濃度下,斑馬魚幼魚的睡眠潛伏期和夜間的覺醒活動量分別表現為較低幅度的減少和較低幅度的增加。2.時間序列分析結果顯示,正常斑馬魚幼魚的睡眠行為大多發生在一天之中的夜間,而覺醒活動大多發生在一天之中的白天,呈現出明顯的晝夜節律。與正常對照比較,經不同濃度酸棗仁湯給藥處理的幼魚表現出明顯的睡眠總時間延長和不同程度的覺醒活動量增加。經酸棗仁給藥處理的幼魚表現出不同程度的睡眠總時間增加,覺醒的活動量減少。與酸棗仁相似,經酸棗仁皂苷A給藥處理的斑馬魚幼魚睡眠總時間延長,覺醒的活動量減少。此外,經酸棗仁湯、酸棗仁和酸棗仁皂苷A處理的幼魚同時保留有睡眠/覺醒行為的晝夜節律,表現為在夜間有較長的睡眠時間,在白天有較多的覺醒活動。相反,褪黑素處理的幼魚其睡眠/覺醒晝夜節律趨于扁平化。3.定量分析顯示,與空白對照比較,低濃度和中濃度酸棗仁湯處理后的斑馬魚幼魚夜間以及白天的睡眠總時間明顯增加(P＜0.05),而高濃度酸棗仁湯處理后的幼魚僅明顯增加了白天的睡眠總時間(P0.05),其夜間的睡眠總時間無顯著變化(P0.05)。此外,中濃度的酸棗仁湯可明顯增加斑馬魚幼魚夜間及白天的覺醒活動量(P0.05),高濃度的酸棗仁湯明顯增加幼魚夜間的覺醒活動量(P0.05),而低濃度的酸棗仁湯對幼魚的覺醒活動量無明顯影響(P＞0.05)。與空白對照比較,中濃度和高濃度的酸棗仁分別明顯增加了斑馬魚幼魚夜間和白天的睡眠總時間(P0.05),低濃度的酸棗仁對幼魚的睡眠總時間無明顯影響(P＞0.05)。此外,高濃度的酸棗仁明顯降低了幼魚白天的覺醒活動量(P0.05),其余濃度對幼魚的覺醒活動量均無明顯影響(P＞0.05)。與空白對照比較,在中濃度的酸棗仁皂苷A作用下,斑馬魚幼魚的睡眠總時間顯著增加(P0.05),而在低濃度和高濃度的酸棗仁皂苷A作用下,斑馬魚幼魚的睡眠總時間分別僅在夜間和白天顯著增加(P0.05)。此外,中濃度的酸棗仁皂苷A顯著降低斑馬魚幼魚白天的覺醒活動量(P0.05),所有測試濃度的酸棗仁皂苷A對夜間的覺醒活動量均無顯著影響(P＞0.05)。4.濃度間行為表型穩定性分析結果顯示,酸棗仁湯低、中、高3個不同濃度間存在較高程度的相關性(濃度間皮爾森相關系數均0.7)。酸棗仁低、中、高3個不同濃度間存在較高程度的相關性(濃度間皮爾森相關系數均0.65)。酸棗仁皂苷A低、中、高3個不同濃度間也存在較高程度的相關性(濃度間皮爾森相關系數均0.8)。5.酸棗仁皂苷A與已表征化合物的行為表型相關性分析發現,酸棗仁皂苷A誘導的行為表型與靶向5-HT能和DA能遞質系統的化合物具有較高的相關性。其中5-HT能化合物所占比例更大。層次聚類分析發現,所有藥物/化合物分為4大類,其中,低、中、高濃度的酸棗仁皂苷A與調節5-HT能、DA能、GABA能、組胺能、腎上腺素能、腺苷能及褪黑素能的化合物歸為一大類,而5-HT能和DA能活性化合物占據較大比例。再深入分類發現,低濃度酸棗仁皂苷A與D2多巴胺激動劑、5-HT再攝取抑制劑、D2/3多巴胺激動劑、5-HT再攝取抑制劑以及mGluR5谷氨酸拮抗劑聚為一類。中濃度和高濃度的酸棗仁皂苷A與D2/3多巴胺激動劑、A3腺苷拮抗劑、5-HT1A受體激動劑、α 1腎上腺素拮抗劑聚為一類。6.秀麗線蟲5-HT依賴性咽部抽吸運動檢測結果顯示,在所測試濃度(30和100μM)下,酸棗仁皂苷A顯著增加了野生型N2線蟲的咽部抽吸頻率(P0.05)。然而,所有測試濃度的酸棗仁皂苷A均沒有對tph-1突變線蟲的咽部抽吸頻率產生明顯影響(P＞0.05)。7.實時熒光定量PCR結果顯示,與正常對照相比,暴露于酸棗仁皂苷A的幼魚中的sert mRNA表達水平顯著下調(P0.05),而5-HT1A的mRNA表達水平無明顯變化(P0.05)。結論:1.酸棗仁湯、酸棗仁及酸棗仁皂苷A在斑馬魚幼魚中均有促進睡眠的作用,酸棗仁皂苷A是酸棗仁湯安眠效應的活性成分之一。2.酸棗仁湯對斑馬魚幼魚的睡眠/覺醒行為的影響表現為抑制和興奮的雙向調節作用,而酸棗仁、酸棗仁皂苷A僅表現為抑制的單相效應。3.酸棗仁皂苷A可能通過介導5-HT信號通路發揮安眠作用。