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            G-四鏈體二聚體/硫磺素T復合物熒光性能研究

            景少春  
            【摘要】:作為一種重要的生物大分子,核酸可組裝成多種結構,在特定的細胞環境中發揮精確的生物學功能。G-四鏈體(G-quadruplex,G4)由富含鳥嘌呤(G)的核酸序列組裝而成,是一種特殊的核酸二級結構。四個鳥嘌呤堿基間通過Hoogsteen氫鍵連接形成G-四分體(G-quartet),兩個及以上G-四分體再通過堆積作用形成G4。硫磺素T(ThT)能夠特異性地結合G4,從而使其熒光強度顯著提高。但G4單體/ThT的量子產率較低,且體系穩定性較差。G4還有多聚體結構,并且對于G4多聚體與ThT的相互作用鮮有報道。本論文系統研究了 ThT與G4二聚體的結合作用,重點考察了 G4二聚體對ThT熒光的增強效應,篩選出可顯著增強ThT熒光強度的G4二聚體,探索了 G4二聚體/ThT作為熒光探針在生物傳感中的應用。具體研究內容如下:一、G-四鏈體二聚體/硫磺素T復合物熒光性能研究G4二聚體是近年來發現的一種高階G4結構,具有獨特的結構和生物學功能,被證明是篩選配體時較優的結合位點,而對于G4二聚體對ThT的熒光性能研究,未見文獻報道。PW17是一個常用于形成G4單體的富G核酸序列。在實驗中,我們偶然發現兩個串聯PW17序列可直接折疊成穩定的G4二聚體,此G4二聚體可以顯著增強ThT的熒光強度。G4二聚體/ThT的熒光強度約為相應的G4單體/ThT的9倍。與普通的G4/ThT體系相比,G4二聚體/ThT體系具有更穩定、更強的熒光發射能力。利用熒光和圓二色光譜(CD)手段,較詳細地研究了 G4二聚體與ThT的相互作用。在此基礎上,以G4二聚體/ThT為熒光指示劑,構建了一個無標記的弓形DNA探針,用于對目標DNA的熒光檢測。此弓形DNA探針的檢出限低于常規的G4型分子信標探針。本研究表明,G4二聚體是一種有效的增強ThT熒光的核酸結構,此研究為構建高靈敏檢測目標物的傳感方法提供了新的思路。二、G-四鏈體二聚體/硫磺素T結合滾環擴增高靈敏檢測DNA滾環擴增(RCA)是一種較常用的恒溫核酸信號放大方法。傳統的RCA遵循線性放大機制,此法堿基利用率以及擴增效率低。本研究中,在滾環擴增的環狀DNA模板中引入G4二聚體(D-PW17)的互補序列,且在其兩端設置核酸內切酶的識別位點。在Phi29聚合酶和dNTPs的存在下,目標DNA與模板雜交,觸發滾環擴增反應,產生大量的D-PW17序列。同時,由于核酸內切酶的切割作用,產生了大量的目標核酸類似物,參與滾環擴增反應,生成更多的D-PW17序列。最后,所生成的D-PW17序列與ThT相結合,形成D-PW17/ThT復合物,產生強的熒光發射,通過檢測體系熒光信號實現對目標DNA的檢測。此方法利用核酸內切酶的作用,消除了擴增時在D-PW17序列兩端產生的其它核酸序列對熒光探針信號的影響,并且實現信號的指數放大。本法具有高的靈敏度。檢出限為10 aM,遠低于以G4單體/ThT為信號探針的滾環擴增體系。本研究提出了一種非標記法高靈敏測定DNA的方法,此傳感靈敏度高,選擇性好,具有很好的應用前景。


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