貫葉連翹bZIP基因家族鑒定及HpbZIP14、HpbZIP69基因功能研究

【摘要】：貫葉連翹(Hypericum perforatum L.)又稱貫葉金絲桃、千層樓等,既是金絲桃科、金絲桃屬的多年生草本植物,又是我國重要的藥用植物。貫葉連翹具有抗病毒、抗氧化、抗炎、抗菌等多種藥理作用,其提取物加工的制劑被廣泛應用于治療抑郁癥、甲型肝炎、乙型肝炎等多種疾病。目前,有關貫葉連翹干旱響應的分子機制研究較少?，F有研究表明,bZIP轉錄因子參與植物生長發育、光形態建成等多種生物學過程中的基因調控,特別是在非生物及生物脅迫的抗逆反應中起重要作用。本研究基于貫葉連翹全基因組數據對貫葉連翹bZIP基因家族進行了系統的生物信息學分析,初步確定了貫葉連翹響應干旱脅迫的兩個基因,即HpbZIP14和HpbZIP69,通過對這兩個基因功能的進一步研究,探索其響應干旱的分子機制,以及對貫葉連翹生長發育的影響。主要研究內容及結果如下:1.基于貫葉連翹全基因組數據庫,共鑒定出79條HpbZIP基因。通過系統發育及進化分析,將HpbZIP基因家族分成了 10個亞家族;利用生物信息學軟件對該家族所有成員進行了生理生化分析、基因結構分析、蛋白保守基序分析以及GO注釋;運用實時熒光定量PCR技術對所有基因在貫葉連翹不同組織部位的表達模式進行了分析,并從不同亞家族中分別選取具有代表性的1-2個基因,對這些基因在脅迫處理下的基因表達模式進行分析;為了進一步研究貫葉連翹bZIP家族基因的功能,對該基因家族成員啟動子區域的順式作用元件進行了統計分析,結果顯示貫葉連翹bZIP家族中具有各類生物及非生物脅迫響應元件的基因數量較多,其中具有干旱響應元件的基因數量為64條。2.以擬南芥bZIP家族基因功能的相關研究結果為參照,以AtbZIP36的抗旱機制為參考,通過系統進化分析可知,貫葉連翹bZIP基因家族中,HpbZIP14和HpbZIP69與擬南芥中AtbZIP36進化聚類最為緊密,具有bZIP保守結構域,相似度達到96%,推測HpbZIP14和HpbZIP69這兩條基因可能與AtbZIP36具有類似的功能,并進一步對其進行相應的功能研究。3.通過qRT-PCR方法對HpbZIP14和HpbZIP69進行基因表達分析:檢測HpbZIP14和HpbZIP69這兩條基因分別在干旱、高鹽和外源激素ABA處理條件下的表達情況。結果顯示在外源激素ABA誘導下,HpbZIP14和HpbZIP69這兩條基因表達量顯著上調,并且這兩個基因對干旱、高鹽都表現出應激反應,尤其在干旱處理不同時間段后,基因HpbZIP14和HpbZIP69的表達量均顯著提高。4.構建貫葉連翹HpbZIP14和HpbZIP69兩個基因的pEarleyGate103亞細胞定位載體,通過基因槍轉化法將定位載體轉入到洋蔥表皮細胞中,發現HpbZIP14和HpbZIP69定位在細胞核中,符合轉錄因子在核內轉錄調控的一般特點。5.借助Gateway技術構建了HpbZIP14和HpbZIP69過表達載體,通過農桿菌介導的花序浸染轉化法對擬南芥進行遺傳轉化,獲得了 18個HpbZIP14的過表達植株和22個HpbZIP69的過表達植株,并從DNA水平和RNA水平進行驗證。6.通過對土培20d的轉基因幼苗進行實時定量PCR檢測及半定量檢測,結果顯示,與野生型相比,轉基因擬南芥植株的基因表達量顯著增加。從HpbZIP14和HpbZIP69的過表達植株中各選取3個表達量較高的株系(HpbZIP14:OE-2、OE-5和OE-9;HpbZIP69:OE-1、OE-3和OE-6)進行后續的功能研究。7.將擬南芥基因突變體bzip1 4/bzip69、WT和T3代轉基因擬南芥3個株系的試管苗分別放于濃度為0 mmol· L-1、100 mmol·L-1、250mmol·L-1的甘露醇培養基中培養7d。結果顯示:在沒有添加甘露醇的培養基中,突變體、轉基因和野生型種子均萌發;在濃度為100 mmol·L-1的甘露醇培養基中,突變體、野生型和轉基因植株的根長均有不同程度的下降,相較于轉基因植株而言,突變體和野生型植株根長下降幅度較大;在濃度為250mmol· L-1的甘露醇培養基中,突變體、野生型和轉基因植株主根的生長被明顯抑制,植株葉片變小、顏色變深,葉邊緣發黃,但轉基因植株的根長大于野生型,側根數量多于野生型,且生長狀態優于野生型。8.對干旱處理15d的過表達擬南芥植株進行表型觀測及相關生理指標檢測。(1)觀察干旱脅迫后HpbZIP14和HpbZIP69過表達株系與對照株系(CK,即野生型和突變體)的表型,結果顯示:HpbZIP14和HpbZIP69過表達株系葉片狀態較好,葉片大部分仍為綠色,只是葉邊緣發黃,植株呈現出初步開花趨勢。對照株系葉片呈明顯的萎蔫狀態,葉片較小,葉大部失水黃化,甚至脫落,植株已發育至開花晚期狀態。復水3d后,干旱處理的過表達株系表型恢復,而野生型和突變體表型未恢復;干旱脅迫與未進行干旱脅迫的HpbZIP14和HpbZIP69轉基因土培植株相比,干旱脅迫的植株莖稈細軟,生長發育較快,葉片稀薄且邊緣黃化。未進行干旱脅迫的植株莖稈挺立,營養生長時間較長,葉片大且厚實,未出現明顯的葉片黃化現象。(2)利用LC-MC技術檢測未進行干旱脅迫和進行干旱脅迫的過表達及對照株系(CK)褪黑素的含量,結果顯示:不論是否進行干旱脅迫,HpbZIP14和HpbZIP69過表達株系中褪黑素的含量均高于對照株系;未進行干旱脅迫的HpbZIP14和HpbZIP69過表達株系相較于干旱脅迫的過表達株系,褪黑素的含量略高一些。(3)對過表達株系和對照株系的相關生理指標進行檢測。結果顯示:過表達株系中超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著高于對照株系(P0.05);丙二醛(MDA)含量顯著低于對照株系(P0.05),過氧化氫及活性氧含量低于對照株系。綜上所述,本研究對貫葉連翹bZIP基因家族進行了基本的生物信息學分析,為貫葉連翹bZIP家族成員功能的深入研究奠定了基礎;其次,對HpbZIP14和HpbZIP69在抗旱及生長發育方面的功能進行了初步探究,為進一步研究貫葉連翹抗旱及其生長發育調控的分子機制奠定了基礎。