丹參SmMYB52基因的克隆及其功能的初步研究

【摘要】：丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根是我國傳統中藥材,有促進血液流通、提高身體機能的功效,已有多年藥用歷史。丹參具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集的功能,被用來治療糖尿病、心絞痛、冠心病、高血脂、腦血管疾病、痛經和閉經等。丹參由于世代周期短、基因組較小、生長要求條件低、組織培養和轉化體系較完善等特點,已逐漸被用作研究藥用植物次生代謝調控的模式植物。丹參作為根莖類藥材,其有效成分含量及根的產量是丹參品質的主要指標,目前關于丹參有效成分含量的研究已有較多報道,但是關于丹參根生長發育的研究尚未見報道。MYB轉錄因子家族是植物界最大的轉錄因子家族之一,在植物的生長發育、控制細胞命運、調控代謝產物和脅迫應答等方面發揮著重要作用。已知擬南芥中R2R3-MYB轉錄因子AtMYB93是擬南芥側根發育的負調控因子,本課題對AtMYB93與丹參中所有R2R3-MYB家族成員進行了親緣關系分析,發現AtMYB93與SmMYB52相似度最高,推測SmMYB52有可能參與丹參根的生長發育調控?；诖?本課題以SmMYB52為研究對象,對其功能進行初步的研究。主要研究內容與結果如下:1.分別從gDNA和cDNA水平上克隆得到SmMYB52(GenBank登錄號:KF059406)的全長序列:該基因序列全長1041 bp,包含2個內含子序列和879 bp的CDS,編碼292個氨基酸。生物信息學分析結果顯示:SmMYB52與擬南芥AtMYB93相似性達46.03%,SmMYB52的相對分子質量為32.27kD,理論等電點6.48,預測不穩定參數為52.47,蛋白疏水性平均系數-0.416,因此推測SmMYB52是酸性親水的不穩定蛋白質。該蛋白含有2個MYB重復序列,這兩個MYB重復序列分別是由51和49個氨基酸殘基組成。2.對SmMYB52的啟動子區進行了克隆和分析,通過軟件PlantCARE分析了SmMYB52的啟動子區:該區域包含脫落酸響應元件、赤霉素響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、光響應元件和其它順式作用元件。qRT-PCR測定SmMYB52在各器官中的表達:該基因在根、莖、葉和花中均有表達,根中表達量最高,莖中最低。用 0.1 mM GA3,0.1 mM IAA,0.1 mM ABA 和 5 mM MeJA 分別對 60 日齡的丹參進行處理,對SmMYB52的表達量進行檢測;qRT-PCR結果顯示,SmMYB52對這四種激素都有響應。3.通過在線軟件WOLFPSORT預測得到SmMYB52蛋白定位在細胞核;為了研究SmMYB52的亞細胞定位,我們利用Gateway技術將SmMYB52構建到pEarleyGate103上,獲得融合蛋白表達載體pEarleyGate103-SmMYB52,利用根癌農桿菌介導的洋蔥表皮細胞瞬時表達實驗進行亞細胞定位分析,結果顯示:SmMYB52-GFP融合蛋白在細胞核和細胞膜中均有分布。4.利用Gateway技術將克隆得到的SmMYB52構建到酵母表達載體pGBKT7中,與pGADT7共轉化至酵母AH109菌株中,將其在SD/-Trp-Leu-His-Ade四缺固體培養基上培養。我們發現,在四缺培養基上,陽性對照細胞生長,陰性對照細胞不生長;實驗組細胞在四缺固體培養基上也可以生長。實驗結果說明,SmMYB52作為轉錄因子,有自激活活性。5.構建了SmMYB52的過表達載體和干涉載體,利用根癌農桿菌介導的葉盤法轉化丹參。經過篩選和DNA水平上的驗證,得到SmMYB52的2個過表達株系(OE-1 和 OE-2)和 3 個干涉株系(myb52-1、myb52-2和myb52-3)。利用 qRT-PCR 檢測轉基因株系中SmMYB52的表達情況,結果顯示,過表達株系OE-1和OE-2中SmMYB52的表達量顯著提高,分別是對照的252倍和551倍;干涉株系myb52-1、myb52-2和myb52-3中SmMYB52的表達量顯著降低,分別是對照株系的36%、53%和 29%。6.觀察了過表達株系 OE-1、OE-2 和干涉株系myb52-1、myb52-2、myb52-3根的表型,檢測了其生物量。與對照相比,SmMYB52過表達株系OE-1、OE-2的根的長度更短、體積更小,生物量降至20%以下;干涉株系myb52-1、myb52-2和myb52-3表型沒有顯著差異、生物量沒有顯著增加。綜合以上,我們得出以下結論:SmMYB52作為R2R3-MYB家族轉錄因子,對丹參根的生長發育具有調控作用,而且為負調控作用。這為我們進一步研究SmMYB52在丹參中發揮的具體功能以及SmMYB52調控丹參根生長發育的機制奠定了基礎。