貫葉連翹WRKY基因家族鑒定及HpWRKY85基因功能研究

【摘要】：貫葉連翹(Hypericum perforatum L.)為金絲桃科(Hypericaceae)多年生草本植物,以干燥地上部分入藥。隨著藥理作用的深入研究,它的商業價值日益凸顯,市場需求量不斷增加,野生資源采集和現有人工種植規模難以滿足市場需求,擴大貫葉連翹的種植面積是當務之急。貫葉連翹對環境適應能力強,在全國大部分地區都可以推廣種植,但濕潤半濕潤地區是我國糧食作物與經濟作物的主要產區,可用于種植貫葉連翹等藥用植物的土地面積有限。因此在干旱半干旱地區推廣貫葉連翹種植成為緩解其資源短缺問題的重要手段之一,弄清楚貫葉連翹的抗旱分子機制是實現其在干旱半干旱地區大面積種植的前提和基礎。作為一類重要的轉錄因子,WRKY基因在植物抵御逆境脅迫的過程中發揮著重要的調控作用。因此,本研究基于貫葉連翹全基因組數據庫對WRKY家族基因進行全面的生物信息學分析和表達分析,篩選出一條響應干旱脅迫的基因Hp WRKY85,進一步通過探究過表達HpWRKY85轉基因擬南芥植株響應干旱處理的表型、生理特性及分子機制,為進一步了解Hp WRKY85基因在貫葉連翹抗旱分子機制中的作用提供資料。主要研究內容及結果如下:1.利用本實驗室測序并完成的貫葉連翹基因組數據庫,通過比對篩選獲得86條貫葉連翹WRKY基因家族成員,將其命名為HpWRKY1～Hp WRKY86,并進行一系列包括理化性質、系統發育和結構域分析、基因結構和保守基序分析、啟動子順式作用元件分析及GO注釋的生物信息學分析,從而將86個HpWRKY蛋白歸為Group 1～3三大組,第二大組又可以分為Group 2a～2e五個亞組;同一組HpWRKYs的WRKY結構域、鋅指結構、基因結構和保守基序分布及其特點具有極高的相似性;許多與激素、生物和非生物脅迫響應相關的順式作用元件在Hp WRKY基因啟動子區域被發現;蛋白的功能分類顯示HpWRKYs廣泛參與了植物體內的生物過程。其次分析了不同組織部位及不同脅迫處理下基因的表達模式,結果顯示HpWRKY基因表達呈現特異性和多樣性,并篩選獲得一條在組織低表達但在干旱、SA和MeJA脅迫處理下表達量分別上調為對照組的85倍、58倍和188倍的基因Hp WRKY85,推測該基因可能是貫葉連翹中響應SA、MeJA和干旱等逆境脅迫的關鍵基因。2.設計克隆引物擴增得到基因HpWRKY85 cDNA序列,全長567 bp,編碼188個氨基酸。同時借助軟件分析了 HpWRKY85蛋白的信號肽、跨膜結構域、親水性/疏水性、二級和三級結構及其特點得到,HpWRKY85蛋白作為一個典型的鋅指蛋白,有較強的親水能力,但不具有信號肽和跨膜結構域。進一步利用Gateway技術構建Hp WRKY85-pEarleyGate103亞細胞定位載體,洋蔥表皮細胞瞬時表達結果顯示HpWRKY85蛋白定位在細胞核,說明該基因在核內起轉錄調控的作用。3.利用Gateway技術構建HpWRKY85-pEarleyGate202過表達載體,轉化擬南芥得到過表達HpWRKY85的轉基因株系。對擬南芥進行甘露醇模擬干旱處理,觀察到過表達株系主根長度平均是野生型的1.45倍。對土壤中的擬南芥植株進行干旱處理,檢測到野生型擬南芥處理組比對照組的丙二醛(MDA)含量升高了105.31%,而過表達株系平均只升高了 28.96%;此外,與過表達株系相比,野生型擬南芥葉片中活性氧(ROS)的含量更高。顯示過表達Hp WRKY85的擬南芥與野生型植株相比,表現出更好的抗旱性。進一步通過qRT-PCR技術,發現干旱條件下HpWRKY85過表達株系中脅迫相關基因AtDREB2A、AtNCED3、AtRD29A及AtRD29B的轉錄豐度顯著高于野生型,推測轉錄因子Hp WRKY85通過上調這些基因的表達來增強抗旱能力。綜上所述,本研究通過對貫葉連翹WRKY家族成員的系統分析,為貫葉連翹WRKY基因功能的研究奠定了基礎。初步明確了基因Hp WRKY85的過表達能夠降低干旱脅迫下植株體內活性氧和丙二醛的積累,減輕了逆境對植物的損傷程度,在植物抗旱過程中發揮積極的作用,為進一步研究貫葉連翹的抗旱機制提供科學依據。