基于代謝組學的孕激素去氫孕酮對斑馬魚的毒理效應

【摘要】：人工合成孕激素的消耗量遠遠大于雌激素或雄激素,近二十年來其在環境研究中備受關注。許多孕激素影響魚類的性別分化及繁殖,包括影響配子生成、產卵、性別分化和激素水平。去氫孕酮(dydrogesterone,DDG)是一種人工合成孕激素,廣泛應用于婦產科疾病,包括激素替代治療和復發性流產等。去氫孕酮是許多國家最常用的合成孕激素之一,在各種水環境中均有發現。最近的研究表明,環境中的去氫孕酮可能對魚類產生內分泌干擾效應,它能增加斑馬魚的排卵后卵泡和閉鎖卵泡的比率、促進卵子和精子生成、造成雄性偏多的性別比例和擾亂晝夜節律。因此去氫孕酮具有生態危害風險。已有多項研究證實去氫孕酮對斑馬魚有不良影響,大多數研究是基于組織學和轉錄組學方法,但是其對魚類代謝的影響的數據還很匱乏。代謝物是細胞生理過程的最終產物,其變化可視為生物對遺傳或環境變化的最終反應。代謝組學是對生物樣品中所有代謝物進行綜合分析的方法,已成為研究毒理機制的有效手段。因此,通過代謝組學方法研究去氫孕酮引起的代謝物變化及其相關通路是有意義的。本研究的目的是利用代謝組學、組織學和傅里葉變換紅外光譜(FTIR)等方法探討去氫孕酮影響斑馬魚的毒理效應。我們將斑馬魚胚胎分別暴露于0(C)、2.8(L)、27.6(M)和289.8(H)ng/L的去氫孕酮中。在暴露的第35天取部分幼年斑馬魚(35 dpf)進行代謝組學和紅外光譜分析。其余斑馬魚仍暴露于去氫孕酮中直至性成熟(共140天),然后分析暴露組和對照組斑馬魚的性腺、腦部和肝臟的代謝組學、組織學和FTIR變化。并結合本研究的結果和前人的相關研究結果分析去氫孕酮干擾斑馬魚生理功能的機理。所取得的主要進展包括:(1)去氫孕酮影響斑馬魚幼魚的生理狀態并以劑量依賴的方式增加雄性斑馬魚的百分比。紅外光譜分析結果表明去氫孕酮導致35 dpf的斑馬魚幼魚體內脂質和蛋白質的積累。幼魚的代謝組學分析結果表明去氫孕酮使部分游離脂肪酸(特別是n-3多不飽和脂肪酸(PUFAs))、甘油單酯、?；鈮A和有機酸水平升高,而溶血磷脂、尿酸和膽汁酸水平下降。去氫孕酮暴露也降低了單磷酸核苷和UDP-糖的含量,而增加了核苷及其堿基的含量。這些代謝物變化可能抑制了NF-κB/COX-2和Wnt/β-catenin通路,或激活了p53通路,從而導致斑馬魚幼魚卵母細胞凋亡并開啟卵巢向精巢的轉化,最終導致更多斑馬魚發育為雄魚。(2)去氫孕酮影響了斑馬魚性腺的生理狀態和生殖功能。組織學切片結果顯示,暴露140天后,去氫孕酮促進了成年斑馬魚性腺中卵子發生和精子發生。去氫孕酮導致雌魚卵巢內的排卵后卵泡和閉鎖卵泡增加。精巢紅外光譜結果顯示脂質的減少和DNA的增加。卵巢紅外光譜結果顯示蛋白質的積累。卵巢代謝組學結果顯示,去氫孕酮增加了由蛋白質和脂質等大分子分解代謝形成的游離氨基酸、尿素、腐胺、游離脂肪酸、?；鈮A和溶血磷脂等代謝物的濃度。去氫孕酮可能通過某些代謝物誘導卵母細胞成熟、排卵和卵母細胞過熟?；ㄉ南┧崮苷T導卵母細胞成熟,而5-oxo-6,8,11-eicosatetraenoic acid(5-oxo-ETE)及嘌呤能信號通路的代謝物能促進排卵。然而,前列腺素PGF2α含量下降可能會抑制產卵和受損卵泡組織降解,這解釋了卵母細胞過熟的出現和閉鎖卵泡的增加。(3)去氫孕酮影響了斑馬魚腦部的生理狀態和晝夜節律功能。紅外光譜的結果顯示暴露組斑馬魚腦部核酸和碳水化合物含量的減少以及蛋白質二級結構的變化。暴露組雌魚還出現脂質積累。代謝組學結果顯示,暴露組斑馬魚腦中膽固醇、飽和脂肪酸和單磷酸核苷的含量均增加,而多不飽和脂肪酸、溶血磷脂和核苷的含量則降低。本研究中去氫孕酮引起的代謝物變化與我們前期研究中去氫孕酮引起的生物鐘基因變化有明顯的相關性。因此,去氫孕酮處理組斑馬魚腦部的代謝譜可能是晝夜節律紊亂的反映,某些代謝物如飽和脂肪酸、膽固醇和n-3PUFAs的變化可能是去氫孕酮干擾正常晝夜節律的一種途徑。(4)去氫孕酮影響了斑馬魚肝臟的生理狀態。組織切片結果顯示去氫孕酮導致雌性斑馬魚肝臟發生形態學改變,但對雄性斑馬魚肝臟沒有影響。紅外光譜結果顯示去氫孕酮暴露導致雄魚肝臟中脂質和蛋白質有關的吸收減少和糖類相關的吸收增加,但對雌魚肝臟的影響不一樣。代謝組學結果顯示兩種性別的斑馬魚肝臟的代謝物本底濃度有差異。且雌魚肝臟中很多代謝物被去氫孕酮增加,而雄魚肝臟中大部分代謝物被去氫孕酮降低。這些結果表明去氫孕酮對斑馬魚肝臟的影響有顯著的性別差異性。斑馬魚肝臟中與代謝相關的基因存在天然的性別差異性,這可能導致了雌雄肝臟代謝物本底水平的差異。脂質等代謝物對去氫孕酮響應的性別差異可能與細胞色素P450(CYP)酶有關,因為CYP3A65等酶既能代謝去氫孕酮又能代謝脂肪酸等內源性物質。綜上所述,去氫孕酮暴露導致了斑馬魚組織形態、生物大分子和小分子代謝物的改變。去氫孕酮主要通過脂肪酸(包括飽和脂肪酸、n-6 PUFAs和n-3 PUFAs)和嘌呤能信號通路的代謝物干擾了斑馬魚的性別分化、生殖和晝夜節律等生理功能。本研究有助于理解和應對孕激素類物質對水生生物的危害。