基于PXR-CYP3A參附配伍相互作用的機制研究

【摘要】：參附方由紅參和附子組成,是臨床中常見的中藥配伍藥對,主要用于急慢心力衰竭、心肌梗死等疾病。紅參和附子是兩種具有悠久歷史的傳統中藥。紅參(人參的加工品)在中國、日本、韓國等國家應用廣泛,其具有抗腫瘤、免疫增強、降血壓、改善心腦血管等藥理學活性。紅參提取物中包含多種皂苷類成分如人參皂苷Rg1、Rb1、Rc、Rd、Rg3、Rh1、Rf等。附子為毛茛科植物烏頭的子根加工品,主要用于治療心力衰竭、心肌梗死、休克、支氣管哮喘等疾病。附子中包含多種生物堿類成分,如雙酯型生物堿和單酯型生物堿。其中雙酯型生物堿(Diester Alkaloids,DAs)包括烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿,已被證明是附子中的主要毒性成分,同時也是附子中重要的藥效成分。在多項研究中證實烏頭類雙酯型生物堿具有很強的心臟毒性和神經毒性,具有強大的強心作用。大量的基礎研究及臨床報道發現,紅參與附子配伍使用可降低附子的心臟毒性,但其作用機制尚不明確。本課題組前期通過超高效液相色譜-飛行時間質譜(Ultra Performance Liquid Chromatography time-of-flight mass spectrometer,UPLC-Q/TOF-MS)評價參附配伍前后各單體成分溶出的變化,發現參附配伍后,雙酯型生物堿的溶出減少而單酯型生物堿的溶出增加,通過構建穩定轉染的hPXR-CYP3A4 HepG2細胞株,利用報告基因法快速、高效篩選參附方中各單體成分對PXR-CYP3A4的調控作用,結果發現紅參中多種單體成分如人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1可調控PXR介導的CYP3A4酶活性,但是各單藥對PXR-CYP3A4調控作用的趨勢并不一致。細胞色素P450酶(Cytochrome P450,CYP450)是肝臟中參與藥物Ι相代謝的主要酶系,其包含多種亞型,如CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4等。孕烷X受體(Pregnane X receptor,PXR)是核受體的超家族中的一員,在線粒體、內質網中合成后進入細胞核內激活CYP3A基因的表達,使其活性升高,進而影響外源性藥物在體內的代謝。前期研究證實PXR能介導藥物代謝酶參與中藥毒性成分的體內過程,起到減毒增效作用,但產生這種毒-效關系的內在機制值得探尋,因此我們擬開展基于藥物代謝酶的中藥配伍相互作用(Drug-drug interaction,DDI)研究為解釋配伍后毒性-藥效變化提供理論依據?；谇捌诘难芯拷Y果,在國家自然科學基金重點項目―基于藥物相互作用的參附方毒-效整合分析研究‖的支持下,我們通過整體動物水平、細胞水平、體外構建肝微粒體孵育等繼續探索基于細胞色素酶的參附配伍作用機制,從整體單藥的角度探索紅參對轉錄調控因子PXR及其介導的CYP450酶活性的影響,并明確其對附子中主要毒效成分雙酯型生物堿的體內代謝影響是否相關。全文從四個階段展開,首先利用三重四級桿串聯質譜評價連續給藥紅參后對附子中雙酯型生物堿在大鼠體內藥代動力學變化,明確紅參是否可以影響附子中雙酯型生物堿的體內代謝。其次,再連續給藥大鼠紅參提取液后,利用探針藥物法及分子生物學方法檢測大鼠體內CYP450酶亞型的活性、基因及蛋白表達水平,以考察紅參對大鼠體內CYP450酶亞型活性變化的影響。再次,利用酶抑制劑和重組人源肝微粒體酶兩種體外孵育方法鑒定代謝雙酯型生物堿的主要CYP450酶亞型,以探究何種CYP450酶亞型參與雙酯型的體外代謝。最后,通過心肌左冠狀動脈前降支結扎術建立大鼠心肌損傷模型,連續給藥紅參單藥、附子單藥及紅參加附子,觀察參附配伍對心肌損傷大鼠的治療作用。實驗結果顯示,連續給藥紅參后,與對照組相比,紅參中、高劑量組三種DAs的AUC_((0-t))均升高。且紅參中、高劑量組3種DAs的Vz/F,烏頭堿的代謝清除率(CLz/F),中、高劑量組的中烏頭堿和次烏頭堿的CLz/F均較對照組下降。表明紅參可抑制附子中雙酯型生物堿在大鼠體內代謝。探針藥物法結果發現紅參連續給藥后,CYP3A2的探針底物咪達唑侖的代謝受到抑制,且大鼠肝臟內PXR及CYP3A2的基因及蛋白的表達水平也受到抑制。通過加入特異性的CYP450酶抑制劑結果發現,僅當CYP3A4的特異性抑制劑酮康唑加入后,肝微粒體孵育體系內烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿的代謝受到抑制,而其他幾種CYP450酶的抑制劑對DAs的代謝影響不大。重組人CYP450酶的研究結果顯示僅重組人CYP3A4酶可以代謝三種雙酯型生物堿,并發現多種代謝產物。而其他幾種CYP450重組酶無法減少孵育體系內的三種雙酯型生物堿的含量,也無代謝產物出現,說明烏頭堿,中烏頭堿,次烏頭堿均為CYP3A4的代謝底物,而非CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1代謝底物。最后參附配伍對心肌損傷大鼠的治療作用評價結果發現,參附配伍組心肌損傷大鼠心臟功能、臟器指數、心肌損傷的組織病理學變化、血清中炎癥因子變化等均有不同程度的恢復,且優于紅參及附子單藥組。利于非靶向性代謝組學的方法尋找可能相關的脂質代謝變化,結果發現手術后鳥氨酸代謝通路中的多種關鍵分子受到影響,而參附配伍后可逆轉其變化。通過Western bolt方法檢測自噬相關蛋白LC3,P62的表達情況發現,心肌損傷大鼠心臟自噬明顯增加,附子單用時可以增強自噬,與紅參配伍后可降低附子增強自噬的特點?；谝陨辖Y果我們認為紅參可以通過調控PXR抑制CYP3A4酶的活性,進而影響附子中雙酯型生物堿的代謝,增加極低劑量的雙酯型生物堿在體內的作用時間,增強療效。并且,紅參可通過降低附子引起的心肌自噬增強效應降低附子使用過程產生中的心臟毒性。本研究也揭示PXR-CYP3A在參附方毒-效關系轉換中的作用和地位,為中藥毒-效整合分析研究提供新靶點。該工作也為中藥復方毒-效關系轉換研究提供示范,為安全合理用藥提供科學依據。